樣本預(yù)處理：決定提取效率的第一步

培養(yǎng)細(xì)胞需先去除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的PBS漂洗兩遍。貼壁細(xì)胞可用細(xì)胞刮刀收集，避免胰酶消化過度損傷蛋白。組織樣本需剪切成小塊，液氮研磨或勻漿器破碎，整個(gè)過程保持低溫。

裂解液與蛋白酶抑制劑的配合

KTP3003試劑盒提供的裂解液含有溫和的非離子去污劑，能選擇性破壞胞漿膜而不溶解膜蛋白。每1mL裂解液需添加10μL蛋白酶抑制劑混合物，在冰上預(yù)混后使用。抑制劑失效是提取失敗的主要原因，分裝儲(chǔ)存的抑制劑需避免反復(fù)凍融。

裂解操作的關(guān)鍵參數(shù)

加入裂解液后，用移液器反復(fù)吹打10-15次，冰上孵育20分鐘。每5分鐘渦旋震蕩一次，每次5秒。過度震蕩會(huì)導(dǎo)致核膜破裂，混入核蛋白；震蕩不足則胞漿蛋白釋放不-徹-底-。孵育時(shí)間不宜超過30分鐘，否則去污劑可能開始溶解膜蛋白。

離心分離的轉(zhuǎn)速與時(shí)間

4℃下以12,000×g離心15分鐘。上清液即為胞漿蛋白組分。注意不可使用更高轉(zhuǎn)速，否則微小細(xì)胞碎片會(huì)沉淀不-完-全-，污染上清。取上清時(shí)避免觸及沉淀，建議保留約50μL液體在離心管中。

蛋白定量前的脫鹽處理

提取的胞漿蛋白含有去污劑和高濃度鹽，會(huì)干擾BCA法檢測。推薦使用脫鹽柱或透析方式處理小體積樣本。若直接定量，需設(shè)置裂解液空白對照，并將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋于相同裂解液中。

分裝與凍存規(guī)范

單次實(shí)驗(yàn)用量分裝成小管，每管50-100μL。-80℃凍存可保存6個(gè)月。避免反復(fù)凍融，每次解凍后蛋白活性下降約15%-20%。使用前冰上解凍，不可加熱或渦旋。