組織與細胞樣本的前處理

己糖激酶（HK）存在于細胞質(zhì)中，線粒體結(jié)合型HK在腫瘤細胞中比例較高。勻漿緩沖液需含5mM葡萄糖，以保護酶活性中心免于失活。推薦配方：50mM HEPES（pH 7.5），150mM KCl，5mM MgCl?，5mM葡萄糖，1mM DTT，0.1% Triton X-100。組織樣本按1:10（w/v）勻漿，4℃ 10000g離心15分鐘，取上清。線粒體結(jié)合型HK需用0.5% Triton X-100洗脫。HK對凍融敏感，新鮮樣本活性最高，-80℃保存不超過2周。

反應(yīng)體系與偶聯(lián)酶系統(tǒng)

HK催化葡萄糖 + ATP → 葡萄糖-6-磷酸（G6P）+ ADP。偶聯(lián)G6P脫氫酶（G6PDH）：G6P + NADP? → 6-磷酸葡萄糖酸 + NADPH + H?，檢測340nm NADPH生成。反應(yīng)混合液（1mL）：50mM HEPES（pH 7.5），5mM MgCl?，5mM ATP，2mM NADP?，2U/mL G6PDH，2mM葡萄糖，適量樣本。預(yù)熱至30℃，加入葡萄糖啟動反應(yīng)。空白對照不加葡萄糖或樣本。注意：ATP與Mg2?比例需保持1:1，游離Mg2?不足時HK活性下降。

葡萄糖濃度與底物特異性

HK對葡萄糖的Km值約0.05mM，高親和力。測定體系中葡萄糖濃度應(yīng)≥0.5mM，確保底物飽和。避免使用過量葡萄糖（>10mM），高滲環(huán)境影響酶活性。HK也能磷酸化果糖、甘露糖等，但反應(yīng)速率僅為葡萄糖的10-30%。若樣本含其他己糖，需設(shè)置不加葡萄糖的對照，扣除背景。組織樣本中內(nèi)源性G6P會干擾，用脫鹽柱或透析去除。

酶量優(yōu)化與線性范圍

HK活性在不同組織差異顯著：肝臟約0.5-2 U/mg蛋白，腦組織約5-10 U/mg?？刂痞340/min在0.05-0.20之間。ΔA過低時增加樣本體積或濃縮；ΔA過高時稀釋樣本。稀釋液用含1mg/mL BSA的緩沖液，防止酶吸附。線性區(qū)間通常持續(xù)5-10分鐘，取前3分鐘計算速率。若曲線彎曲，檢查ATP是否耗盡（ATP濃度需≥2mM）。每批實驗運行純化HK標(biāo)準(zhǔn)品（酵母來源，Sigma H6380）。

常見干擾與校正

內(nèi)源性G6P：樣本中含G6P會直接生成NADPH，設(shè)置不加葡萄糖的對照管扣除。6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶：將G6P進一步氧化，產(chǎn)生額外NADPH，但速率較慢，短時監(jiān)測影響小。NADPH氧化酶：消耗NADPH導(dǎo)致活性低估，加入1mM DTT抑制。己糖激酶同工酶區(qū)分：若需區(qū)分HK1/HK2/HK3，采用熱失活法（HK2在45℃不穩(wěn)定）或使用特異性抑制劑（2-脫氧葡萄糖）。

結(jié)果計算與單位換算

HK活性（U/mg蛋白）= (ΔA/min × 總體積ml) / (6.22 × 光徑cm × 樣本體積ml × 蛋白mg)。注意NADPH與NADH消光系數(shù)相同（6.22 mM?1·cm?1）。使用微孔板時，光徑按0.5cm計算。標(biāo)準(zhǔn)曲線法：用純化HK配制0.1-2 U/mL，測定ΔA/min繪制曲線。蛋白濃度用BCA法，避免Bradford法（受Triton X-100干擾）。批內(nèi)CV應(yīng)<5%，批間CV<8%。