細胞凋亡檢測試劑盒的操作全流程

更新時間：2025-09-19

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　　細胞凋亡是機體維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵機制——通過程序性細胞死亡清除受損或冗余細胞(如發(fā)育過程中的指間細胞、免疫系統(tǒng)的老化淋巴細胞)，其形態(tài)學特征(細胞皺縮、染色質(zhì)凝聚、凋亡小體形成)與生化標志物(如磷脂酰絲氨酸PS外翻、Caspase酶激活)與壞死(細胞腫脹、膜破裂)截然不同。細胞凋亡檢測試劑盒通過靶向這些特異性標志物，實現(xiàn)對凋亡程度的精準定量與定性分析，廣泛應用于腫瘤研究、免疫學及藥物毒性評估。

　　一、操作全流程：

　　1.樣本制備：

　　•貼壁細胞：棄培養(yǎng)基，PBS輕洗2次，加入胰酶消化(無需全部解離，觀察到細胞變圓即終止)，離心(1000rpm，5分鐘，4℃)后PBS重懸，調(diào)整細胞密度至1×10?-1×10?cells/mL(懸浮細胞直接離心重懸)。

　　•組織樣本：取新鮮組織(如脾臟、腫瘤，約0.1-0.3g)，剪碎后用膠原酶(1mg/mL)37℃消化30-60分鐘(間歇震蕩)，PBS過濾(40μm濾網(wǎng))去除組織碎片，離心后重懸細胞。

　　2.檢測方法選擇與操作(以Annexin V-FITC/PI雙染法為例，靶向PS外翻與膜完整性)：

　　•試劑孵育：將細胞懸液(100μL，約1×10?cells)加入離心管，依次加入5μL Annexin V-FITC(標記外翻的PS，早期凋亡標志)和5μL碘化丙啶(PI，標記壞死細胞或晚期凋亡細胞破裂的核DNA，終濃度約5μg/mL)，輕輕混勻，避光室溫孵育15分鐘(若檢測Caspase酶活性，需提前30分鐘加入Caspase底物探針)。

　　•上機檢測：加入400μL 1×Binding Buffer(試劑盒配套，維持離子強度)，混勻后上流式細胞儀或熒光顯微鏡檢測。

　　3.結(jié)果分析：

　　•流式細胞儀：橫坐標為FITC(Annexin V)熒光強度(綠光)，縱坐標為PI熒光強度(紅光)。四象限結(jié)果中：左下象限(Annexin V?/PI?)為正常細胞；右下象限(Annexin V?/PI?)為早期凋亡細胞(PS外翻但膜完整)；左上象限(Annexin V?/PI?)為壞死細胞(膜破裂)；右上象限(Annexin V?/PI?)為晚期凋亡細胞(PS外翻且膜破損)。凋亡率=(早期凋亡+晚期凋亡)細胞百分比。

　　•熒光顯微鏡：綠色熒光(Annexin V-FITC)標記早期凋亡細胞，紅色熒光(PI)標記壞死細胞，疊加圖像可直觀觀察不同狀態(tài)細胞的比例。