反應方向與動力學參數(shù)

TPI催化磷酸二羥丙酮（DHAP）與3-磷酸甘油醛（G3P）的互變，平衡常數(shù)[G3P]/[DHAP] ≈ 0.05，反應強烈偏向DHAP方向。kcat（催化常數(shù)）高達~4000 s?1，接近擴散極限（10? M?1·s?1），是已知催化-效-率-較高的酶之一。Km值：DHAP約0.5mM，G3P約0.3mM。測定TPI活性通常用逆向反應：G3P → DHAP，偶聯(lián)α-磷酸甘油脫氫酶（GPDH）消耗NADH，檢測340nm吸光度下降。

檢測波長與消光系數(shù)

NADH在340nm的摩爾消光系數(shù)為6.22 mM?1·cm?1。TPI活性測定時推薦使用340nm，因為G3P和DHAP在此波長無吸收。若樣本顏色較深或濁度高，改用雙波長（340nm和380nm）或熒光法（激發(fā)340nm，發(fā)射460nm）。熒光法靈敏度提高10倍，檢測下限可達0.001 U/mL。反應體系pH 7.6（三乙醇胺緩沖液），溫度25℃或30℃，溫度每升高10℃反應速率增加約1.5倍。

線性范圍與最小檢測活性

標準比色法線性范圍0.01-1.0 U/mL。細胞裂解液中TPI活性較高（常見0.5-2 U/mg蛋白），需稀釋50-200倍后測定。稀釋緩沖液含1mg/mL BSA防止酶吸附損失。檢測下限：比色法0.005 U/mL，熒光法0.0005 U/mL。對于血清樣本（TPI活性低，約0.01 U/mL），需增加樣本體積至100μL（總反應體積1mL）或使用熒光法。

干擾物質(zhì)的耐受閾值

NH??濃度>10mM抑制TPI活性（與酶活性中心的賴氨酸殘基競爭）。Hg2?、Ag?、Cu2?在0.1mM即-完-全-抑制，使用含EDTA的緩沖液螯合。磷酸鹽（>50mM）改變反應平衡。甘油（>10%）增加溶液粘度，降低擴散速率，稀釋樣本時控制甘油終濃度<5%。硫酸銨（>0.2M）沉淀酶蛋白。若樣本為硫酸銨沉淀后的重懸液，需脫鹽處理。

酶活性單位換算

1個TPI活性單位（U）= 每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol底物。比活力（U/mg）反映酶純度：純化TPI比活力約5000-8000 U/mg（酵母來源）。商業(yè)TPI（Sigma T6258）比活力約5000 U/mg。測定蛋白濃度時注意：TPI不含色氨酸，280nm吸收弱，應使用BCA法或Bradford法。配制標準曲線時用牛血清白蛋白（BSA）作為蛋白標準。

試劑穩(wěn)定性參數(shù)

TPI凍干粉在-20℃可保存2年。溶液態(tài)TPI在4℃一周活性損失<5%，但需加入0.02%-疊-氮-化-鈉-防腐和1mM EDTA螯合金屬離子。避免使用硫柳汞（抑制酶活性）。偶聯(lián)酶GPDH在-20℃含甘油條件下穩(wěn)定6個月。反應混合液（含NADH、G3P、GPDH、緩沖液）需當天新鮮配制，NADH光解導致背景升高。G3P在酸性溶液中穩(wěn)定，但在中性pH易分解，工作液配制后2小時內(nèi)使用。