酶促反應(yīng)的核心步驟

丙酮酸脫羧酶（PDC）催化丙酮酸非氧化脫羧生成乙醛和CO?，反應(yīng)需要焦磷酸硫胺素（TPP）和Mg2?作為輔因子。反應(yīng)分為三步：丙酮酸與TPP的C2碳負(fù)離子結(jié)合形成-羥-乙-基-TPP中間體；-羥-乙-基-TPP發(fā)生脫羧釋放CO?，生成活性乙醛-TPP復(fù)合物；乙醛-TPP質(zhì)子化后解離出乙醛，同時再生游離TPP。該過程在pH 6.0-6.5時活性最高，真核生物PDC位于細(xì)胞質(zhì)，原核生物PDC為組成型表達(dá)。

TPP依賴型脫羧酶的機(jī)制特點(diǎn)

PDC屬于TPP依賴型酶家族，與丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（PDH）的E1亞基同源。關(guān)鍵區(qū)別：PDC直接釋放乙醛，而PDH將-羥-乙-基-TPP轉(zhuǎn)移到硫辛酸。PDC活性不受磷酸化調(diào)控，但受底物抑制（丙酮酸濃度>50mM時活性下降）。酶的底物特異性較寬，可作用于丙酮酸、丙酮酸類似物（如2-氧代丁酸）以及某些酮酸。羥腈酶（oxynitrilase）與PDC不同，催化氰醇裂解生成醛和HCN，兩者不應(yīng)混淆。

輔因子結(jié)合與活性中心結(jié)構(gòu)

每個PDC亞基結(jié)合一個TPP和一個Mg2?。Mg2?通過與TPP的磷酸基團(tuán)配位穩(wěn)定TPP構(gòu)象，同時極化TPP的C2質(zhì)子使其形成碳負(fù)離子。活性中心由保守的谷氨酸和組氨酸殘基構(gòu)成質(zhì)子中繼系統(tǒng)。酵母PDC的四聚體結(jié)構(gòu)（二聚體之四聚體）已解析至2.0?分辨率。酶濃度測定時需注意：比活力在10-50 U/mg范圍內(nèi)（酵母來源），細(xì)菌來源PDC比活力通常較低（5-20 U/mg）。

丙酮酸脫羧與乙醇發(fā)酵的聯(lián)系

在酒精發(fā)酵中，PDC是丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙醇的關(guān)鍵酶。PDC缺失的酵母突變體無法進(jìn)行乙醇發(fā)酵。反應(yīng)生成的乙醛由乙醇脫氫酶（ADH）還原為乙醇，同時再生NAD?。PDC在植物根部缺氧脅迫時誘導(dǎo)表達(dá)，在細(xì)菌（如運(yùn)動發(fā)酵單胞菌）中用于乙醇生產(chǎn)。測定PDC活性常用偶聯(lián)法：乙醛與NADH在ADH作用下生成乙醇和NAD?，檢測340nm吸光度下降。

酶活性測定的關(guān)鍵參數(shù)

反應(yīng)體系（1mL）：50mM MES緩沖液（pH 6.0），1mM MgCl?，0.2mM TPP，50mM丙酮酸，0.2mM NADH，2U乙醇脫氫酶（ADH），適量PDC樣品。37℃孵育，340nm監(jiān)測?？瞻讓φ詹患颖??；钚詥挝唬║）=每分鐘消耗1μmol丙酮酸。注意：丙酮酸在酸性條件下不穩(wěn)定，需新鮮配制。TPP工作液避光保存。ADH中可能含NADH氧化酶雜質(zhì)，選購高質(zhì)量ADH。