樣本采集與保存條件

LDH在室溫下不穩(wěn)定，全血中LDH活性每小時代謝下降5-10%。采血后2小時內(nèi)分離血清或血漿，使用肝素或EDTA抗凝（枸櫞酸鈉抑制LDH活性）。離心條件：4℃，1500g，10分鐘。血清或血漿在4℃可保存24小時，-20℃可保存1周，-80℃可保存3個月。反復(fù)凍融一次活性損失約15%。細(xì)胞培養(yǎng)上清直接檢測或-80℃凍存。組織樣本勻漿后立即測定，勻漿緩沖液使用PBS（pH 7.4）含0.1% Triton X-100。

反應(yīng)體系的配制與加樣順序

采用逆向反應(yīng)（丙酮酸→乳酸）速率更快。反應(yīng)混合液：50mM Tris-HCl（pH 7.4），0.6mM丙酮酸，0.2mM NADH。將2.4mL反應(yīng)混合液預(yù)熱至37℃，加入0.1mL樣本混勻，立即倒入1cm石英比色皿。加樣順序：先加緩沖液和NADH，預(yù)熱后加丙酮酸啟動反應(yīng)，最后加樣本（或樣本與丙酮酸同時加）。記錄340nm處吸光度每分鐘下降值，連續(xù)監(jiān)測3-5分鐘。空白對照用緩沖液代替樣本。

酶量優(yōu)化與線性區(qū)間

LDH活性與ΔA340/min成正比。控制ΔA/min在0.05-0.15之間。ΔA<0.05時增加樣本體積或稀釋倍數(shù)的倒數(shù)（即濃縮樣本）；ΔA>0.15時稀釋樣本。稀釋使用PBS（含0.1% BSA穩(wěn)定酶活性）。反應(yīng)前60秒的線性區(qū)間用于計算，R2需≥0.995。若曲線彎曲（速率下降），說明NADH消耗超過20%或產(chǎn)物抑制，應(yīng)減少樣本量或縮短監(jiān)測時間。

細(xì)胞毒性實驗中的LDH釋放操作

步驟：細(xì)胞接種于96孔板，處理相應(yīng)時間。吸取上清100μL至新孔。同時設(shè)“最大釋放組"（加10μL 10% Triton X-100或1% NP-40裂解細(xì)胞）、“自發(fā)釋放組"（未處理細(xì)胞）、“背景組"（無細(xì)胞培養(yǎng)基）。加入100μL LDH反應(yīng)混合液（含乳酸、NAD?、四唑鹽），避光孵育30分鐘，加入50μL終止液（1M醋酸），測490nm。計算公式：細(xì)胞毒性(%)= (實驗組-自發(fā)組)/(最大組-自發(fā)組)×100%。注意：血清中含有LDH，使用無血清培養(yǎng)基或低血清培養(yǎng)基（<1% FBS）。

結(jié)果計算與單位換算

LDH活性（U/L）= (ΔA/min × 總體積ml × 1000) / (6.22 × 光徑cm × 樣本體積ml)。6.22為NADH在340nm的毫摩爾消光系數(shù)。若使用微孔板，光徑校正為0.5cm。推薦使用標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma LDH from rabbit muscle，活性標(biāo)注500-1000 U/mg），配制0-500 U/L標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋，與樣本同條件測定。每批實驗至少運(yùn)行兩個質(zhì)控水平。

常見操作錯誤與糾正

氣泡干擾：加樣時避免氣泡，比色皿中氣泡導(dǎo)致光散射。NADH光降解：NADH溶液對光敏感，工作液需避光保存，當(dāng)天配制。試劑污染：丙酮酸溶液易被細(xì)菌污染，4℃保存不超過2周。溶血樣本：紅細(xì)胞LDH活性是血清的100倍，輕微溶血即導(dǎo)致結(jié)果假性升高。溶血樣本棄用，重新采血。高血脂樣本：脂血導(dǎo)致濁度干擾，用聚乙二醇沉淀或高速離心（15000g，30分鐘）去除。