谷胱甘肽(GSH)是細(xì)胞內(nèi)較重要的非酶抗氧化劑，由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成(γ-谷氨酰-半胱氨酰-甘氨酸)，通過(guò)提供還原性巰基(-SH)直接中和自由基(如過(guò)氧自由基ROO·)，并參與維持細(xì)胞氧化還原平衡(如協(xié)助維生素C/E再生)。GSH檢測(cè)試劑盒通過(guò)特異性檢測(cè)還原型GSH(rGSH，具有生物活性)或總GSH(tGSH，rGSH+氧化型GSH=GSSG)，成為研究氧化應(yīng)激、藥物毒性及營(yíng)養(yǎng)干預(yù)效果的關(guān)鍵工具。
一、樣本制備：
•血液樣本：全血需立即加入抗壞血酸(1%final濃度)或DTT(二硫蘇糖醇，5mM)作為還原劑，防止紅細(xì)胞破裂后釋放的GSH被空氣氧化為GSSG；血清樣本因不含細(xì)胞，可直接離心(3000rpm，10分鐘)取上清，但需在采血后30分鐘內(nèi)處理(避免血清中殘余血小板釋放GSH)。
•組織樣本：取新鮮組織(如肝臟、腎臟，約0.1-0.5g)，迅速剪碎后加入預(yù)冷的PBS緩沖液(pH 7.4，含1mM EDTA抑制金屬離子催化氧化)，均質(zhì)化后離心(12000rpm，15分鐘，4℃)，取上清液(total protein濃度建議1-5mg/mL)；若檢測(cè)tGSH，需額外加入N-乙基馬來(lái)酰亞胺(NEM，10mM)封閉游離巰基，防止體外氧化。
•細(xì)胞樣本：貼壁細(xì)胞用PBS輕洗2次，加入PBS(含1mM EDTA)刮取或用胰酶消化后離心(1000rpm，5分鐘，4℃)，PBS重懸后再次離心，棄上清后加入裂解液(含5mM DTT)，冰上孵育10分鐘裂解，超聲波破碎(功率20%，30秒×3次)，離心(15000rpm，10分鐘，4℃)取上清。
二、試劑配制：
試劑盒通常包含衍生化試劑(如DTNB，5,5’-二硫代雙(2-硝基苯甲酸)，與GSH反應(yīng)生成黃色2-硝基-5-硫代-2-硝基苯甲酸，5-硫代-2-硝基苯甲酸在412nm有吸收峰)、反應(yīng)緩沖液(維持pH 8.0-8.5，促進(jìn)反應(yīng))、標(biāo)準(zhǔn)品(已知濃度GSH，如0-100μM梯度)及封閉劑(如NEM)。使用時(shí)需現(xiàn)配現(xiàn)用——DTNB溶液避光保存(棕色瓶，4℃可存1周)，緩沖液用去離子水新鮮配制(避免金屬離子干擾)，標(biāo)準(zhǔn)品用PBS稀釋至工作濃度(如1-10μM，每點(diǎn)間隔2μM)。
三、數(shù)據(jù)處理：
•計(jì)算rGSH/tGSH濃度：根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(吸光度值vs.GSH濃度，線性范圍通常0-10μM，R²≥0.99)，將樣本吸光度代入回歸方程，得到樣本中GSH濃度(μM)；若檢測(cè)tGSH(含GSSG)，需先用2-乙烯吡啶(VP)將GSSG轉(zhuǎn)化為rGSH(反應(yīng)15分鐘)，再檢測(cè)總活性，通過(guò)差值計(jì)算GSSG含量(tGSH=rGSH+GSSG)。
•標(biāo)準(zhǔn)化到蛋白量/組織量：結(jié)果通常表示為nmol GSH/mg蛋白(用BCA法測(cè)定樣本總蛋白濃度)或μmol GSH/g組織(用于整體樣本分析)，避免因取樣量差異導(dǎo)致數(shù)據(jù)不可比。
•注意事項(xiàng)：若樣本吸光度超出標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍，需稀釋后重新檢測(cè)；空白對(duì)照(試劑+緩沖液，無(wú)樣本)的吸光度應(yīng)<0.05(排除試劑本底干擾)；重復(fù)檢測(cè)3次取平均值(CV值≤10%為可靠數(shù)據(jù))。
掌握GSH檢測(cè)試劑盒的操作要點(diǎn)，不僅能精準(zhǔn)量化細(xì)胞或組織的抗氧化儲(chǔ)備(如肝組織rGSH正常含量約2-5nmol/mg蛋白)，更能為氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的機(jī)制研究與干預(yù)策略提供可靠數(shù)據(jù)支撐。
更新時(shí)間：2025-09-16
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