細(xì)胞培養(yǎng)概述

永生化人星形膠質(zhì)細(xì)胞 - fetal - hTERT 是一種重要的細(xì)胞模型，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病研究、藥物篩選等領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用。成功的細(xì)胞培養(yǎng)是開展相關(guān)研究的基礎(chǔ)，以下是詳細(xì)的細(xì)胞培養(yǎng)操作使用指南。

培養(yǎng)基的配制與選擇

• 基礎(chǔ)培養(yǎng)基 ：常使用 Prigrow IV 基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加 10% 胎牛血清（FBS）、10ng/ml 人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）、1% L - 谷氨酰胺和 1% 青霉素 / 鏈霉素溶液。也有研究使用 DMEM/F-12（1:1）培養(yǎng)基，添加 10% 未經(jīng)熱滅活的胎牛血清、1% GlutaMAX、100IU/ml 青霉素和 100μg/ml 鏈霉素。

• 培養(yǎng)條件 ：細(xì)胞在 37℃、5% CO?、95% 空氣的條件下培養(yǎng)。

細(xì)胞的復(fù)蘇與凍存

• 細(xì)胞復(fù)蘇 ：收到凍存細(xì)胞后，檢查凍存管是否有解凍破損現(xiàn)象。將凍存管放入 37℃水浴中快速融化，一般 1 分鐘左右。然后將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至離心管，用培養(yǎng)液稀釋后低速離心 3-10 分鐘，去除上清，加入新鮮培養(yǎng)液后培養(yǎng)。收到培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，用 75% 酒精噴灑細(xì)胞瓶消毒，放置培養(yǎng)箱靜置 2-4 小時(shí)穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)，之后顯微鏡下觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況并拍照記錄。

• 細(xì)胞凍存 ：選擇狀態(tài)良好的細(xì)胞，消化后制成單細(xì)胞懸液，按凍存數(shù)量加入含 5% DMSO 的凍存液，輕輕混勻后分裝于凍存管，放入 - 80℃冰箱中，24 小時(shí)后轉(zhuǎn)入液氮罐保存。

細(xì)胞的傳代

當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到 80% 左右時(shí)，即可進(jìn)行傳代。傳代步驟如下：

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加入 0.25%Trypsin-0.53mM EDTA 消化液，放入培養(yǎng)箱消化 1-2 分鐘，顯微鏡下觀察細(xì)胞，若細(xì)胞大部分變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲培養(yǎng)瓶后，加含 10% 血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 輕輕吹打細(xì)胞，使其全脫落，吸出至離心管，1000rpm 離心 5-8 分鐘，棄去上清，補(bǔ)加培養(yǎng)基吹勻。

4. 按 1:2 至 1:4 的比例，將細(xì)胞懸液分到新的培養(yǎng)瓶中，加入適量培養(yǎng)基，放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞培養(yǎng)的觀察與記錄

• 肉眼觀察 ：主要觀察培養(yǎng)基的顏色變化及細(xì)胞生長(zhǎng)情況。若培養(yǎng)基顏色變黃、變渾濁等，可能提示細(xì)胞狀態(tài)不佳或受到污染。

• 顯微鏡觀察 ：定期在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長(zhǎng)狀態(tài)等。正常的永生化人星形膠質(zhì)細(xì)胞 - fetal - hTERT 呈多極形狀，細(xì)胞質(zhì)豐富，核仁明顯等。

細(xì)胞培養(yǎng)的污染與防治

• 污染種類 ：常見的有細(xì)菌、酵母菌、霉菌和病毒等污染。

• 預(yù)防方法 ：嚴(yán)格無菌操作技術(shù)，如在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行操作、使用無菌器械和試劑等；保持操作環(huán)境清潔；使用良好的細(xì)胞來源和培養(yǎng)基配制。

• 檢測(cè)與處理 ：可通過肉眼直接觀察法、培養(yǎng)檢查法、顯微鏡觀察法、PCR 檢測(cè)等方法檢測(cè)污染。一旦發(fā)現(xiàn)污染，應(yīng)及時(shí)采取相應(yīng)的處理措施，如丟棄培養(yǎng)物、使用抗生素等。